Rozwój akwarystyki jaki nastąpił w ostatnich latach powoduje duży wzrost zapotrzebowania na tropikalne rośliny wodne. Szczególną rolę odegrały tu akwaria holenderskie, popularyzujące bogatą i różnorodną obsadę roślinną. Rośliny te uprawiane są na specjalnych plantacjach lecz równie często zbierane ze środowiska naturalnego, co doprowadza w przypadku roślin rzadkich, do poważnego uszczuplenia ich zasobów. Dotyczy to różnych gatunków Cryptocoryne na Borneo, Aponogeton na Madagaskarze oraz niektórych brazylijskich żabienic. W wielu krajach rośliny te objęto ochroną, aby zapewnić im egzystencję w naturalnym środowisku. W związku z tym coraz częściej poszukuje się nowych metod zapewniających szybkie namnażanie roślin do dalszej uprawy. Jest to tym bardziej uzasadnione, gdyż wiele roślin w sztucznych warunkach uprawy nie rozmnaża się generatywnie, a rozmnażanie wegetatywne jest mało wydajne.
Fot. 1 Regeneracja bulwek na eksplantatach Aponogeton
Możliwości takie stwarza metoda kultur in vitro, którą w odniesieniu do roślin wodnych zaczęło stosować na szeroką skalę u schyłku lat siedemdziesiątych. Polega ona na rozmnażaniu roślin z fragmentów tkanek, na sterylnych podłożach mineralnych zawierających cukier, wzbogaconych w regulatory wzrostu i inne dodatki. Dużą trudność sprawia uzyskanie większej ilości wyjściowego, sterylnego materiału rozmnożeniowego, który otrzymujemy z kłączy, bulw i rozłogów, rzadziej z innych organów roślinnych jak kwiaty, młode liście, pyłek. Łatwiejsze do odkażania są młode rośliny, najlepiej jednoroczne. W przypadku młodych kłączy wystarcza kilkuminutowe odkażenie w 70% alkoholu, a następnie przepłukanie sterylną wodą destylowaną. Odkażanie wieloletnich bulw Aponogeton czy kłączy żabienic jest bardziej skomplikowane. W naszych doświadczeniach, po uprzednim dokładnym oczyszczeniu i umyciu odkażano je kolejno: 12% monochloraminą (15-20 min), 5% wodą utlenioną (3 min) i 0,5% roztworem HgCl2 (3 min). Po zastosowaniu każdego z roztworów odkażających bulwy i kłącza płukano w sterylnej wodzie destylowanej. Dodatkowo fragmenty pociętych bulw Aponogeton o wymiarach 0,5 x 0,5 cm odkażano powtórnie w 2% podchlorynie wapnia i 2% wodzie utlenionej.
Badania przeprowadzone w latach siedemdziesiątych pod kierunkiem prof. Kukułczanki we Wrocławskim Ogrodzie Botanicznym pozwoliły na określenie optymalnej pożywki dla rozmnażania Aponogeton natans, A. cirspus, A. elongatus, A. crispus x A. elongatus. Stwierdzono, że jest nią pożywka płynna, a w następnym etapie wzrostu roślin płynno-agarowa Reinerta i Mohra (1967) z dodatkiem 1-2 mg/dm3 IBA lub NAA oraz 1 mg/dm3 BA lub kinetyny. Jednakż Aponogeton ulvaceus w pożywce tej wykazywał stosunkowo słabą regenerację. W toku dalszych badań ustalono, że dla tego gatunku oraz dla żabienic optymalne jest podłoże Murashige i Skooga (1962) z dodatkiem 2 mg/dm3 BA i 0,1 mg/dm3 NAA.
Proces regeneracji przebiegał następująco. Odkażone eksplantaty przenoszono do probówek z pożywką płynną, które umieszczano na rotatorach w fitotronie o temperaturze 24°C i natężeniu światła 2500-3000 lx. Po 4 tygodniach pod powierzchnią skórki bulw Aponogeton rozpoczynały się intensywne podziały komórkowe (prawdopodobnie kambialnych) w wyniku których po dalszych 2-4 tygodniach powstawały małe zielone bulwki. Na ich powierzchni różnicowało się wiele stożków wzrostu z których wyrastały liście. Na tym etapie tkankę pasażowano, dzieląc bulwki na fragmenty zawierające pojedyncze stożki wzrostu, bądź już rozwinięte pędy. Odcięte z fragmentem bulwki pędy rosły tworząc u podstawy powiększającą się bulwkę (Fot. 1), a w ciągu 5 tygodni u nasady liści pojawiały się korzenie (Fot. 2). Dodatkowo na powierzchni powiększającej się bulwki tworzyły się 2-3 bulwki przybyszowe. W przypadku fragmentów bulwek zawierających tylko małe stożki wzrostu na krawędziach eksplantatów powstawało wiele bulwek przybyszowych, rozwijających się podobnie jak to opisano powyżej. Obserwowane zjawisko regeneracji indukowane w tkankach bulw pozwala na ciągłą produkcję dużej liczby roślin. Regeneracja przebiega łatwo, a rozwój roślin następuje szybko. Z jednej bulwy wyjściowej w okresie roku można uzyskać od 300 do 2500 roślin.
Fot. 2 Ukorzeniona młoda roślina Aponogeton
Kłącza Echinodorus horemanii, E. osiris i E. opacus w porównaniu do bulw aponogetonów nastręczały więcej trudności przy odkażaniu, a fragmenty odkażane dwukrotnie miały większą tendencję do nekrozowania. Eksplantaty umieszczano w takiej samej pożywce i analogicznych warunkach temperatury i oświetlenia jak A. ulvaceus. Po 4 tygodniach kultury na powierzchni eksplantatów Echinodorus obserwowano pojawianie się pączków we wgłębieniu tkanki kłącza tuż przy podstawie śladu środkowego nerwu liściowego. Prawdopodobnie następuje tu indukcja rozwoju pączków śpiących. Wybijające pędy przenoszono na pożywkę kombinowaną agarowo-płynną z dodatkiem 2 mg/dm3 kinetyny i 0,1 mg/dm3 NAA, gdzie po 10-14 tygodniach rośliny tworzyły kłącza długości 1,0-1,5 cm. Kłącza te dzielono na fragmenty i ponownie przenoszono na pożywkę płynną w celu ich dalszego rozmnożenia. Po upływie 8 tygodni z jednego fragmentu otrzymywano 2-3 rośliny.
Wynika z tego, że na stosowanych pożywkach udało się jedynie stymulować rozwój pączków śpiących Echinodorus, a więc nie dochodzi tutaj do zjawiska regeneracji. Jest to przyczyną mniejszej efektywności namnażania, jakkolwiek jest ona większa jak w normalnych warunkach uprawy. Szybkość rozmnażania Echinodorus jest ograniczona bowiem produkcją kłączy, a także liczbą znajdujących się na kłączu pączków śpiących. Rośliny Aponogeton i Echinodorus osiągające wzrost 8-12 cm przenoszono na pożywkę MS zawierającą połowę stężenia soli i pozbawioną sacharozy celem aklimatyzacji roślin przed ich wysadzeniem do zbiorników akwaryjnych lub basenów. Zabieg ten nie jest konieczny, ale jego pominięcie rośliny trudniej znoszą i w następstwie wykazują słabszy wzrost w początkowym okresie uprawy. Bardziej skomplikowaną metodę rozmnażania zwartek podaje Möhlmann (1980). Kulturę prowadził on na pożywkach agarowych z wyj n ostatniego etapu aklimatyzacji rośiin w którym stosowano pożywkę płynną. Doświadczenia przeprowadzano także na pożywce Murashige i Skooga o zredukowanej do 20 g/dm3 zawartości sacharozy.
W pierwszym etapie wzrostu, a mianowicie w czasie indukcji pączków podłoże wzbogacano dodatkowo w 10 mg/dm3 cysteiny, 100 mg/dm3 hydrolizatu kazeiny, 2 mg/dm3 glicyny i 1 mg/dm3 BA. Lepsze efekty uzyskano jednak stosując dodatkowo 50 ml/dm3 świeżego mleka kokosowego. Z chwilą pojawienia się pierwszych oznak wzrostu (2 tygodnie) eksplantaty przenoszono na pożywkę zawierającą 1 mg/dm3 GA3, 20 mg/dm3 kinetyny oraz dodawano 3 mg/dm3 glicyny i 1 mg/dm3 kwasu foliowego. W ciągu 8 tygodni kultury na pożywce tej następował szybki rozwój pędów, jednakże nie obserwowano powstawania korzeni. W celu ich indukcji stosowano podłoże zawierające 1 mg/dm3 GA3, 50 ml/dm3 mleka kokosowego i 1 mg/dm3 IBA, a więc dodawano auksynę (IBA) stymulującą tworzenie korzeni. Ukorzenione pędy adaptowano przed przeniesieniem do zbiorników we wstrząsanej pożywce płynnej zawierającej tylko 1 mg/dm3 IBA i 0,3 mg/dm3 GA3. Po upływie 4 tygodni rośliny wysadzano w piasek zalewany 3 cm warstwą wody.
Literatura:
Kukułczanka K., Klimaszewska K., Sławiński S., 1980. In vitro culture of Aponogeton. Tropical Fish Hobbist 29/1:36- 39.
Kukułczanka K., Klimaszewska K., Sławiński S., 1979. Aponogetons in vitro-cultuur. Het Aqarium 49/ /11:293-295.
Kromer K., Kamiński R., 1985. Die Vermehrung einiger Wasserpflanzen- gattungen in den Kulturen in vitro. Aqua-Planta 6 w druku
Móhlmann F., 1980. Erfahrungen mit der Gewebekultur bei Cryptocorynen. Tetra Informacion 50:34-36.
Murashige T., Skoog F.( 1962. A revised medium of rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plantarum 15:473-497.
Reinert R. A., Mohr H. C, 1967. Propagation of Cattleya by tissue culture of lateral bud meristems. Proceedings Am. Soc. Horticultural Science 91: :664-671.
Spis skrótów używanych w tekście:
IAA – kwas indolilo-3-octowy NAA – kwas naftylo-1-octowy IBA – kwas indolilo-3-masłowy BA – 6-benzyloaminopuryna GA3 – kwas giberelinowy